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            生物顯微鏡的內反射熒光技術原理

          1. 發布日期:2020-09-21      瀏覽次數:1031
            •   生物顯微鏡的內反射熒光技術原理
                生物顯微鏡的內反射熒光技術利用全內反射產生的消逝波激發樣品,使樣品表面數百納米厚的薄層內的熒光團受到激發,再用高靈敏度和高時間分辨率的攝像機CCD來捕捉熒光并用計算機進行顯像,從而實現對生物樣品觀測的一種新生技術。由于消逝波特點及CCD的優勢使全內反射熒光顯微鏡具有高信噪比和高時間分辨率,因此它在對單分子的動態觀測具有很高的應用價值。
                利用全內反射產生的消逝波激發樣品,使樣品表面數百納米厚的薄層內的熒光團受到激發,再用高靈敏度和高時間分辨率的攝像機CCD來捕捉熒光并用計算機進行顯像,從而實現對生物樣品觀測的一種新生技術。由于消逝波特點及CCD的優勢使全內反射熒光顯微鏡具有高信噪比和高時間分辨率,因此它在對單分子的動態觀測具有很高的應用價值。
                全內反射熒光顯微鏡根據其結構的不同可分為目鏡型和棱鏡型兩種。
                1.棱鏡型全內反射熒光顯微鏡
                棱鏡型全內反射熒光顯微鏡就是利用激光經過棱鏡并產生全內反射,其消逝波照射已被熒光標記的生物樣品,其激發光從另一側進入目鏡,并被CCD相機捕捉,其光路圖如圖所示。
                從光路圖我們可以看出,棱鏡型系統在實現上更加容易,它只需要激光光源、棱鏡和顯微鏡,它也不容易受到入射光信號的干擾,但由于消逝波在z軸方向上呈指數衰減,只能照射100nm的距離。在探測上,放置樣品的空間收到棱鏡的限制。另外由于目鏡和物鏡同樣品距離近,因此同其他儀器的配合也受到限制。目前棱鏡型全內反射熒光顯微鏡的發展很慢,在科學研究中一般很少用到。
                2.物鏡型全內反射顯微鏡
                在物鏡型全內反射顯微術中,顯微鏡的物鏡即作為收集樣品熒光信號的接收器,同時又作為發生全內反射的光學器件,如圖所示。
                由于細胞的典型折射率為1.33~1.38 ,因此要想實現全內反射,物鏡的NA必須大于1.38。表達式為:
                NA = nsinθ,nsinθ> nsinθc
                NA為物鏡的數值孔徑,n、θ分別為物鏡的折射率(浸沒油)和孔徑角。θc為發生全反射的臨界角。當我們使用NA值為1. 4 的透鏡物鏡時,只有很小的一部分物鏡孔徑范圍(1.4 -1.38=0.02)可以被利用,這顯然增加了光束校準的難度,同時光束的強度也很難提高。如果我們使用NA=1. 65的透鏡物鏡,則有一個大的多的孔徑范圍(1.65-1.38=0.27)可被利用,即有更多的激發光強可以用來產生全反射。
                物鏡型的全內反射熒光顯微鏡在制作要求的技術很高,它是近年來全內反射熒光顯微鏡的發展方向,由于它的物鏡同收集樣品熒光的儀器在同一側,這有助于同其他的儀器等的結合。
                內反射熒光顯微鏡的優勢應用和發展展望:
                全內反射熒光顯微鏡里用消逝波作為陽品的激發光源,并用有著高靈敏度和高時間分辨率的CCD相機捕捉樣品熒光,因此具有如下優點:
                1.信噪比高(相對共聚焦顯微鏡);
                2.分辨率高(相對其他的光學顯微鏡);
                3.對生物樣本損傷小(相對電鏡),可以進行活體物質的研究和單分子的動態研究。
                全內反射熒光顯微術正是憑借其*的優勢,它的熒光激發深度只在~100nm的薄層范圍內,從而成為研究細胞表面科學如生物化學動力學、單分子動力學的前途的光學成像技術。
                全內反射熒光顯微成像法不再采用掃描成像,大大提高了成像速度,可以滿足實時成像的要求;另一方面它的圖像解釋相對于近場,干涉顯微成像來說也較簡單。